文章摘要：NDV鸡胚培养与鉴定一、目的要求•掌握鸡胚接种的方法；•学习NDV的分离培养及其鉴定方法。二、概述（一）新城疫病毒新城疫是禽类的一种高度感染与致死性的疾病。是由一种侵害呼吸道、胄肠道以及中枢神经系统的新城疫病毒（NDV）所引起。病毒存在于病禽的血液、脑、内......
刺挑破一小孔，注意不能伤及绒毛尿囊膜。同时用吸头或洗耳球于气室小孔上轻吸，使三角处绒毛尿裹膜下陷，生理盐水吸入，造成人工气室。（可在检卵器上检视人工气室的确实与否）。
d 、用无菌注射器吸取接种物于三角处小孔．上刺入 0.5~1 毫米，注入病毒液，注射量一般为 0.1~0.2 毫升。轻轻旋转鸡胚，使接种液扩散到人工气室的整个绒毛尿囊膜上。用消毒胶布封闭三角形小口及气室小孔，横放鸡胚，开口向上，于 35~37 ℃温箱中继续孵育。 24 小时后检视，死胎弃去。以后每天检视 1~2 次。
e 、检视出的死鸡胚、孵育 48~72 小时的活鸡胚（或视不同的病毒、不同的实验目的孵育更长时间），取出并用碘酊和酒精棉球消毒人工气室周围蛋壳，去除胶布，用无菌眼科剪、镊子去除人工气室处卵壳、壳膜。剪下人工气室处绒毛尿囊膜置于无菌平皿中，用灭菌生理盐水冲洗，展平后观察痘斑等病理变化。收集绒毛尿囊膜并低温保存、备用。也可收集部分绒毛尿囊膜、固定，供组织病理学切片检查包涵体。
f 、绒毛尿囊膜的另一种接种方法是，检视鸡胚划出胚胎位置及气室界线，用碘酊和酒精棉球消毒，在气室边缘附近将卵壳开一半径约 0.3 厘米的小窗口，左手持鸡胚，使小窗口朝向操作者，右手持注射器用针头将气室边缘的壳膜挑起一小孔，缓缓注入接种物，使接种物渗入壳膜与绒毛尿裹膜之间。用消毒胶布封口，直立放置孵育。或不必开小窗，在大头顶端刺一小孔，插入针头，接种病料于空室内，针头继续深入，刺破卵壳膜及绒毛尿囊膜（约深 1~1.5 厘米），拔出针后封口，卵直立使气室向上，培养几小时后，即可随便翻动。
图 4 鸡胚绒毛尿囊膜接种法
（ 3 ）卵黄囊接种法
a 、选用 5~8 日龄发育良好的鸡胚，检视标出气室及胚胎位置。
b 、气室向上置鸡胚于卵架上，气室端卵壳用碘酊和酒精棉球消毒，用剪刀尖端在气室中央轻刺一小孔。
c 、用注射器吸取接种物，通过气室中央小孔，用长针头（ 3~4 厘米）垂直刺入 2~3 厘米，也可刺入达鸡胚长径的二分之一，注入接种物。注射量一般为 0.2~0.5 毫升。
d 、注射完毕，用熔化石蜡封闭气室小孔，直立鸡胚，干 35~ 37 ℃温箱中继续孵育。 24 小时后检视，死胎弃丢。以后每天捡视 1~2 次。
（ 5 ）继续孵育 24 小时以上死亡或濒死的鸡胚，取出气室向上直立于卵架上，气室周围卵壳用碘酊和酒精棉球消毒，去除气室端卵壳。用无菌镊子撕破绒毛尿囊膜和羊膜，提起鸡胚，夹住卵黄带，分离绒毛尿囊膜，置鸡胚与卵黄囊于平皿内。用无菌生理盐水冲去卵黄，分别将鸡胚和卵黄囊置于无菌容器中，低温冰箱保存备用。如欲作涂片，可取一小块轻轻涂于载玻片上制成薄片。
 另外，由于卵黄是鸡胚的营养供给者，病毒可通过卵黄而进入胚胎，所以收获的胚胎一般病毒滴度也很高。
 
图 5 鸡胚卵黄囊接种法 图 6 鸡胚羊膜腔接种法
（ 4 ）羊膜腔接种法
a 、选用 10 日龄发育良好的鸡胚，照蛋标出气室和胚胎位置。
b 、鸡胚气室向上置子卵架上，用碘酊和酒精棉球消毒气室，将气室顶端开一直径 0.7~1.2 厘米的小窗口。
c 、滴加一滴灭菌液体石蜡于胚胎位置（也可用生理盐水代替石蜡，但透明度较差）。用眼科镊子细心由无血管处穿过绒毛尿囊膜，镊住羊膜，将其提出于绒毛尿囊膜外，使成伞状。
d 、用注射器吸取接种物注入羊膜腔内，接种量一般为 0.1~0.2 毫升。注毕，用灭菌胶布封闭窗口， 35~37 ℃ 温箱直立孵育。 24 小时后检视，死胎弃去。以后每天检视 1~2 次。
e 、经 48 小时或稍长时间的孵育，死胚或活胚按尿囊腔接种法收获时的办法低温处置鸡胚，碘酊和酒精棉球消毒气室卵壳，自气室处打开窗口，用无菌吸管吸出尿囊液，再用眼科镊子轻轻夹起羊膜使成伞状，用一无菌毛细吸管插入羊膜腔内吸取羊水，置灭菌容器中低温保存、备用。方法得当，一般可获得 0.5~1 毫升羊水。
（ 5 ）鸡胚静脉接种
a 、选用 12~14 日龄的鸡胚，暗室中照蛋并标出较粗的静脉，标出其位置和血流方向。
b 、消毒标记处，用锉在卵壳上挫出一个 2~3 毫米宽、 5~6 毫米长的长方形，注意不要伤及壳膜。
图 7 鸡胚静脉接种法
c 、用银子或外科刀挑去该长方形卵壳，在暴露的壳膜上滴加一滴灭菌液体石蜡，使壳膜透明，此时即可见到静脉。
d 、用磨过的 4 号针头顺血流方向刺入静脉内，注射 0.02 毫升接种液。若静脉内出现血流暂时中断，静脉呈白色，表明确已注入静脉。
e 、用灭菌胶布封同卵壳缺口，置温箱中孵育，弃去 24 小时内死胚。
f 、 72~96 小时的死胚或健胚，普通冰箱中静置 4~10 小时，收获胚胎，根据需要，采集相应器官组织，如肌肉、肝、脑等，保存或处理待用。
三、实验材料
1 、 NDV 毒种；
2 、 9~11 日龄鸡胚（ 90 个）；
3 、打孔器、镊子、干棉球、酒精灯、照蛋器；
4 、石蜡；
5 、灭菌瓶子（ 250ml ） 5 个、灭菌吸管。
四、实习内容
1 、 NDV 的尿囊腔接种；
2 、每日照蛋 1 次；弃去 24 小时以内死亡的鸡胚；连续照蛋 3~4 天；
3 、收取 24~72 小时死亡鸡胚的尿囊液（无菌操作），观察鸡胚病变； 4 、时间允许时，可做 HA 实验。
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