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NDV 鸡胚培养与鉴定    热      【字体：小 大】
NDV 鸡胚培养与鉴定
作者：佚名    文章来源：不详    点击数：    更新时间：2007-8-26


文章摘要：NDV鸡胚培养与鉴定一、目的要求•掌握鸡胚接种的方法；•学习NDV的分离培养及其鉴定方法。二、概述（一）新城疫病毒新城疫是禽类的一种高度感染与致死性的疾病。是由一种侵害呼吸道、胄肠道以及中枢神经系统的新城疫病毒（NDV）所引起。病毒存在于病禽的血液、脑、内......


NDV 鸡胚培养与鉴定

一、目的要求

•  掌握鸡胚接种的方法； •  学习 NDV 的分离培养及其鉴定方法。

二、概述

（一）新城疫病毒

新城疫是禽类的一种高度感染与致死性的疾病。是由一种侵害呼吸道、胄肠道以及中枢神经系统的新城疫病毒（ NDV ）所引起。病毒存在于病禽的血液、脑、内脏、粪便和口鼻分泌物中。世界各国对新城疫病毒的研究已有 50 多年的历史，广泛应用各种疫苗进行免疫也有 20 多年。虽然如此，国内外对本病的控制仍没有完全解决，鸡新城疫仍然对养鸡业有着巨大的威胁。 1 、病毒的特性 （ 1 ）形态与结构 新城疫病毒是属于副粘病毒科的副粘病毒属。有囊膜的病毒粒子通常呈圆形，但常因囊膜破损而形态不规则。成熟病毒粒子的直径约为 100~250 纳米。囊膜上的纤突长约 8 纳米。病毒核衣壳的直径约 17 纳米。新城疫病毒很不稳定，用乙醚处理后病毒粒子彻底破坏，释出形状不规则的凝絮状结构，直径 35~65 纳米。病毒囊膜的纤突具有血凝素和神经氨酸酶活性。 （ 2 ）理化特性 核酸类型是单链 RNA 病毒，浮密度为 1.212~1.221 克 / 毫升（为禽细胞培养病毒），病毒 RNA 在 0.1M 的 NaCl 中的沉降系数为 50~57S 。能通过百克菲氏 N 号与 V 号滤烛或蔡氏 EK 号滤板。在 55 ℃ 经 45 分钟灭活，在 4 ℃ 经数周，在 -20 ℃ 经数月，在 -70 ℃ 经数年感染力不受影响。说明该病毒对理化因素的抵抗力相当强。 （ 3 ）病毒的致病力和病毒株分类 新城疫病毒的主要特性之一，是它的致病力表现非常大的差异。用如下三种方法评定新城疫病毒株的致病力，即：脑内接种致病指数（ ICPI ），静脉接种致病指数（ IVPI ）和鸡胚接种死亡时间平均数（ MDT ）。根据这些指数，将鸡新城疫病毒分三大类：①弱毒力株：致病力微弱，大多数活毒疫苗都用它们制备。②中等毒力株：具有中等致病力，有些毒株用作加强免疫时的疫苗毒株。③强毒力株：有高度致病力，用作检验疫苗效价时的攻击强毒株。 （ 4 ）生物学特性 病毒囊膜上含有两种抗多肽原：一是血凝素，它可以凝集不同动物的红细胞，二是神经氨酸酶，它可解离被凝集的红细胞，而释放出新城疫病毒。该病毒在细胞培养中的特性是：红细胞吸附作用，即被被病毒感染的细胞能将红细胞吸附在其表面上；细胞融合，被病毒感染的鸡胚细胞可形成多核细胞（即合胞体）；蚀斑形成。 2 、病毒分离 （ 1 ）病料与处理 分离病毒的病料应采自早期病例，病程较长的病例不适宜分离病毒。病鸡扑杀后应无菌操作取脾、脑和肺组织。生前可采取呼吸道分泌物。将病料制成 1:5~1:10 的乳剂，并于每毫升加入青霉素和链霉素各 1000 单位，置冰箱中处理 2~4 小时，以抑制可能污染的细菌，然后离心沉淀，取其上清液作接种材料。同时，应对接种材料作无菌检查。取接种材料少许接种于肉汤、血琼脂斜面及厌氧肝汤各一管，于 37 ℃ 培养观察 2~6 天，应无细菌生长。如有细菌生长，应将原始材料再作除菌处理，也可用细菌滤器过滤除菌。但过滤后的滤液含毒量减少，应引起注意。因此，如有可能再次取材料。 （ 2 ）接种鸡胚 常用不含有母源抗体的 9~11 日龄的鸡胚（非免疫胚或 SPF 胚）取上述处理过的材料 0.1~0.2 毫升接种于鸡胚尿囊腔内，并继续孵育。每日照蛋二次，连续 5 日。接种 24 小时以后死亡的鸡胚，放 4 ℃ 冰箱，气室向上，冷却 4 小时以上。然后无菌收获尿囊液，并做无菌检查。浑浊的尿囊液应弃去。留下无菌的鸡胚液放低温冰箱保存以供进一步鉴定。在收获毒液的同时，检查鸡胚病变。由新城疫病毒致死的鸡胚，整个胚体充血，在头、胸、背、翅、和趾部有小点出血，尤以翅和趾部明显。 （ 3 ）细胞培养 最常用鸡胚成纤维细胞培养 NDV 。其他如 Hela 细胞、猴肾细胞，人羊膜细胞等在医学上对分离人感染 NDV （急性粒状结膜炎）较为常用。待培养细胞瓶内细胞长成单层后，吸弃生长液，然后将上述经处理的含毒材料，接种细胞瓶内，每瓶滴 0.1 毫升，留数瓶不接病料作为对照。然后放 35 ℃ 温箱内继续培养。如有鸡新城疫病毒，接种的 24~48 小时用显微镜观察，可见细胞病变，细胞变圆，融合成多核巨细胞，最后细胞坏死脱落。 3 、病毒鉴定 对分离的病毒材料，可用血凝试验和血凝抑制试验，血细胞吸附和吸附抑制试验，中和试验，空斑减数试验和荧光抗体技术等方法加以鉴定。无论做哪一种试验，最好使用一株标准鸡新城疫病毒（例如用一株鸡新城疫疫苗毒）作对照。 血凝试验和血凝抑制试验 新城疫病毒血凝试验 * 此处的生理盐水代替红细胞凝集抑制试验中的血清。 # 为完全凝集； ++ 为不完全凝集；－为不凝集。 （ 1 ）血凝试验（ HA ） 鸡新城疫病毒可以凝集多种动物红细胞，但凝集性能不够稳定，故通常多采用鸡的红细胞。被检材料可用含毒鸡胚液，或含毒细胞培养液（要冻融 2~3 次，使细胞破裂释出病毒）。 操作方法：按下表将各种试验材料加入各试管中。混合均匀，置室温（ 20~30 ℃ ） 15 分钟，每 5 分钟观察一次，观察到 1 小时，判定结果。或置 18~22 ℃ 中 45~60 分钟后观察结果。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，称为该病毒的血凝滴度。如表所示病毒滴度为

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