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流感病毒的实验室快速诊断方法

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流感病毒的实验室快速诊断方法

作者：佚名文章来源：不详点击数：更新时间：2007-8-26

文章摘要：流感病毒的实验室快速诊断方法流感病毒在病毒分类学上属正粘病毒科（Orthomyxovindae）、流感病毒属。由流感病毒引起的急性呼吸道传染病称为流感。虽然流感与普通感冒在治疗上目前均以对症治疗为主(如使用新康泰克等有效药物)，但流感却有着它的特异性。其在流行病学上最显著的特点是......

温箱5—10min，在此期间应在光学显微镜下观察1—2次，当细胞变圆，细胞与细胞问互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。但千万别消化时间过长，造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。
　　5.倒掉消化液，每瓶加入9m1Eagle’s MEM生长液，用毛细吸管将瓶壁上细胞轻轻吹下吹散。
　　6.吸出6mI接种2小瓶，3m1／l瓶，把原瓶留下。置37℃恒温箱培养。
一般情况下，一瓶细胞传3瓶，如细胞急着用，也可一传二。有时不急着用，可一传四等。有时为了控制细胞的代数，可一传八，这样一星期传一代就可以了。一般情况每2—3天需传代一次。

　　(二)成片细胞的维持
细胞已成片如继续培养，则易老化甚至脱落。因此，成片细胞如不能当天应用，可放室温(20℃左右)或可换成含2％小牛血液的维持液，每5—7天换一次液，一般可维持1—3个星期。

　　(三)第二代细胞的制备
利用第二代细胞培养病毒的优点是单层细胞一般较原代细胞生长均匀。在组织来源缺乏或原代细胞成片后不能立即应用时，可做第二代细胞的细胞培养。方法是将原代成片细胞瓶的生长液倒掉，用Hank’s液洗一次，根据瓶的大小加人能盖满成片细胞的0.1％一25％胰酶，pH7.6，放37℃或室温2—3分钟，将瓶倒放使细胞朝上液体在下面，在显微镜下观察，细胞如开始收缩，即将胰酶倒掉，加人生长液吹打并分散细胞。生长液的量可按原量2倍加，即一瓶传二瓶。

　　(四)病毒感染
　　将已成片的细胞弃生长液，用Hank’s液洗2遍，将残余的牛血清洗净，因牛血清中含有流感病毒的非特异性抑制素，会影响流感病毒的复制。感染分离病毒标本，置33—35℃吸附1—2h，倒掉感染液，再用Hank’s洗1—2遍，加入维持液，其量相当于或两倍于生长液。置33—35℃孵育。当进行病毒传代或滴定时，可不必吸附，将病毒用维持液稀释后直接加入。

　　流感病毒引起受感染细胞病理变化(CPE)出现时间随感染病毒的型别、甚至毒株的差异以及感染量的大小而异。进行病毒分离时，一般7天之内还不出现CPE，多半为阴性标本。进行病毒传代和滴定时，一般在72h之内会出现CPE。大多数病毒株的复制高峰约在感染后72h。当CPE出现十十十一十十十十号时进行收获，收获之前将细胞冻融1—2次，可提高收获标本的病毒滴度。收获的标本需冰冻保存，最好置一70℃以下并与残余细胞一齐保存，因维持液中只含有胰酶而不含血清，在4℃，尤其室温保存时能很快使病毒滴度下降或丢失。

　　流感病毒在细胞中连续传代，很难将其滴度提高，常常反而使滴度下降。维持液中红细胞凝集活性测定：用无菌的毛细吸管取3—4滴维持液，置大孔塑料板中，然后加人1％豚鼠或人或鸡的红细胞，轻轻摇匀，置室温或4℃30一60min后观察结果。红细胞吸附测定见此后章节。

红细胞凝集及凝集抑制试验一、概况流感病毒粒表面的血凝素(HA)蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构。流感病毒的受体为含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，许多哺乳类动物和禽的红细胞表面均含有此两种成分，因此，它们均能被流感病毒所识别和结合，并发生红细胞凝集现象。过去一般认为流感病毒只有HA蛋白才具有凝集红细胞的能力，但近来发现N9亚型流感病毒也具有凝集红细胞的能力，同时还发现N9蛋白分子上含有与HA相似的识别和结合红细胞表面受体的结构。
　　流感病毒虽然能凝集多种哺乳类和禽类的红细胞，但应用最广泛的为脉鼠、鸡和人“O”型的红细胞。

　　二、红细胞凝集试验
　　(一)材料
　　1.0.85％NaCl。
　　2.大孔或小孔塑料板。
　　3.10m1和1m1吸管或稀释棒。
　　4.1％红细胞悬液。
　　以鸡红细胞为例来加以介绍。于10或20m1注射器中先吸入约3m1阿氏液(A1sever’s Solution)，然后从鸡翅静脉或心脏采集，用生理盐水洗涤3次，头两次1500r／min离心5min，最后1次同速离心10min，弃上清，用无菌生理盐水配成1％悬液，置4℃待用。一般置4℃能保存7天左右，一旦发生溶血应弃掉。

　　(二)操作步骤
　　1.常量法，也称大量法
　　(1)拿一块干净的大孔塑料板，标记所要测定的标本名称。
　　(2)于塑料板第一孔加入0.2m1(1:2开始稀释)或0.4m1(1:5开始稀释)，从第二孔开始一律各加入0.2m1。
　　(3)如1：2开始稀释，于第一孔中加入0.2m1病毒悬液；如1:5开始稀释，于第一孔中加入0.1m1病毒悬液。用吸管轻轻吹打第一孔，使会充分相混，吸出o.2m1放入第二孔，以相同方式一直至最后一孔。最后一孔吹打后，应弃掉0.2m1。如做1:5开始稀释，第一孔应还得吹掉0.1ml。
　　（4）于每孔中加入0.2ml 1%红细胞悬液，轻轻摇匀，置室温或4℃30一60min后观察结果。
　　（5）观察结果：以++++ ，+++ ，++ ，+ ，± ，— 来表示。
　　一层红细胞均匀地铺于孔底上者为 ++++
　　一层红细胞铺于孔底，面积稍小，边缘不整齐者为 +++
　　红细胞形成一个环状，周围有小凝集块者为 ++
　　红细胞形成一个小团，但边缘不整齐有小凝集块者为 +
　　红细胞于孔底形成一个小团，边缘整齐有立体感，将血凝板倾斜片刻，可见红细胞滑动如泪滴状则为 —± 为可疑，计算时以 — 处理。
　　（6）红细胞凝集滴度计算：
结果以++为终点，也就是一个血凝单位。它表明最高稀释度的病毒能引起++的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度，简称血凝滴度。理论推算，出现++的高一个稀释度应为—，低一个稀释度应为++++，但结果常常不是这样，因此必须进行计算。为方便计算，以表3—1为例介绍计算方法：
表3—1 红细胞凝集单位计算实例　　四个血凝单位计算：将血凝单位除以4，如表3—1中标本3，它的四个血凝单位应为：640／4＝160，即将标本1进行1：160稀释时，其稀释液就是含四个血凝单位。请注意!1：160稀释应为1m1病毒悬液加159m1稀释液(一般用生理盐水)。
　　2.微量法
　　除用小孔塑料板，稀释用稀释棒或稀释枪，总量为0.05m1(病毒0.025m1，红细胞悬液0.025m1)外，其余同常量法。

　　三、红细胞凝集抑制试验
　　(一)材料
　　1.红细胞凝集试验中所有材料。
　　2.受体破坏酶(RDE)。
　　3.免疫血清或测定血清。

　　(二)操作步骤
　　红细胞凝集抑制试验简称血抑测定(HI test)，在流感病毒研究中分为常量和微量法，其区别见血凝测定。国内在两法基础上又分为常规法(稀释好血清加入病毒后，立即加入1％的红细胞)；半加敏法(病毒加入稀释血清中，置室温结合66min，然后加入红细胞)；加敏法(病毒经乙醚裂解，同时抗原与血清在室温结合2h后，再加入红细胞)。

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