流感病毒的实验室快速诊断方法 流感病毒在病毒分类学上属正粘病毒科（Orthomyxovindae）、流感病毒属。由流感病毒引起的急性呼吸道传染病称为流感。虽然流感与普通感冒在治疗上目前均以对症治疗为主(如使用新康泰克等有效药物)，但流感却有着它的特异性。其在流行病学上最显著的特点是：突然爆发、迅速蔓延、波及面广。由于以上这些原因，在临床上对流感和普通感冒迅速作出鉴别诊断就有着重要的意义。随着流感实验技术的发展，流感快速诊断技术也不断进步，不仅实验方法更加敏感，实验时间也不断缩短：最传统的鸡胚培养法、组织培养法3天可报告实验结果，酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫荧光实验当天可报告实验结果，而使用Directigen试剂盒可以在15分钟内完成整个实验。下面将介绍几种流感快速诊断实验方法。

　　流感病毒的经典实验室诊断方法
　　在这里，我们将介绍流感实验中最常使用的鸡胚培养法、组织培养法等。这类实验的特点是：实验结果准确可靠，不需要太多昂贵的辅助设备；在完成快速诊断的同时，可以获得大量的病毒材料以供科学研究和疫苗研究。但实验所需时间相对较长。 鸡胚培养法
　　一. 方法简介：
　　 鸡胚培养法的优点：它的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒；是个整体，有神经血管的分布及脏器的构造；来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。3天可报告结果。

　　二.实验材料
　　(一)7—11日龄鸡胚
　　(二)孵卵箱：孵卵箱要有两个，一个39℃，放正常鸡胚用，另一个33—35℃，放接种流感病毒后的鸡胚。
　　(三)捡卵灯，照明灯，开卵钻和卵盘。
　　　　(四)其它 ：注射器，针头，消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)，镊子，灭菌过的生理盐水，毛细吸管，橡皮乳头，酒精灯，试管架，试管，蜡和胶布等。
　　三、鸡胚的结构与生理
　　鸡胚胎是由三个胚层发育起来的，即外胚层，中胚层和内胚层，它们构成胚胎的组织与器官。约10日龄鸡胚的结构见图1—1。


　　四、接种技术
　　(一)活胚检查
　　鸡胚使用前必须进行检查，可根据以下三方面来判断其活死：
　　1．血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。
　　2．胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。
　　3．绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。
必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
图1－1 鸡胚结构 　　(二)接种途径
　　1.尿囊腔接种
　　通常选9一11日龄鸡胚，照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界边缘约1mm处并避开血管作一标记此即为注射点。在点周围用75％酒精消毒，并用蛋钻机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注人流感病毒0.1一0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33—35℃孵箱培养。于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去。
图1—2 鸡胚尿囊腔接种示意图 　　收获时间根据不同病毒而异，甲型流感病毒一般培养44—48h可进行收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是，将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。

　　收获时，用碘酒或75％酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走卵壳，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4℃或低温保存待用。

　　2.羊膜腔接种
　　这个接种途径主要应用于临床材料(如患者咽嗽液等)分离病毒。这种接种可直接感染羊腹腔的内面胚层内，也可被鸡胚咽下或吸人，因此，病毒可感染多种组织。还可产生全胚胎感染。病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此羊膜腔接种分离病毒时，除收获羊水外，还应收获尿液。羊膜腔接种法较多，以下介绍其中一种：选7—10日龄鸡胚经照视后，画出气室边缘及标记胚胎位置，在气室端靠近胚胎侧之卵壳上钻一长方形裂痕(约10×6mm)，勿损伤壳膜，钻口处用75％酒精消毒，用消毒镊子除去长方形卵壳和壳膜外层(壁层)，从孔中滴入一滴无菌液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在壳膜内层(脏层)铺开，此时在照卵灯下即可清楚地看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的领下胸前，用针头轻轻拨动下额及腿，当进入羊膜腔时，能见到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射0.1一0.2ml接种物。以沾有碘酒通过火焰的小块胶布封口，置33—35℃恒温箱孵育。孵育72h后，进行收获，方法和收获尿囊液相同。收获前应先冷冻，用75％酒精消毒气室部分的卵壳，用无菌镊子将消毒过的卵壳打碎，取走，再用无菌镊子将内面的壳膜及绒毛尿囊膜撕开，用无菌毛细吸管吸取尿囊液，然后左手持小镊子夹起羊膜成伞状，右手用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收获0.5—1.0mI羊水。如羊水过少，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取洗液。
图1—3 鸡胚羊膜腔接种示意图 组织培养法 一、概况 由于病毒缺少本身的酶系统，必须依赖宿主细胞的酶和代谢系统才能达到病毒的复制。因此，组织培养技术的原理主要是供应及维持合适的细胞来支持病毒的繁殖。病毒在敏感细胞的复制常常引起细胞病变以及病毒释放到维持液中，可以以此作为病毒的实验诊断、抗原及疫苗的制备。 二、材料
　　(一)Hank’s溶液
　　(二)0.25％胰酶和Versene消化液

　　(三)生长液：含10％一15％胎牛或小牛血清、终浓度分别每m1含l00U，100μg，50U和50μg的青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的Eagle’s MEM或水解乳蛋白溶液，用5.6％NaHCO3将pH调至7.3土0.1。注意，用Eagle’s MEM时应查明是否已含谷氨酰胺，如不含，应每100mI中补加配好的谷氨酰胺1m1。
　　(四)维持液：同培养液，但不含小牛血清，含终浓度为5μg／m1的胰酶。

　　(五)玻璃器材等
　　三、组织培养技术
　　(一)MDCK细胞传代
　　1.先把需用的溶液置室温，使其温度达室温，也可放37℃水浴预温。
　　2.已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。
　　3.把Versene与0.25％胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3m1(加入量应根据瓶大小不同而异)。
　　4.置37℃恒

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