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内源氨基酸测定技术评定

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内源氨基酸测定技术评定

作者：佚名文章来源：中国饲料网点击数：更新时间：2007-9-3

文章摘要：氨基酸的消化率是评定单胃动物饲料蛋白质营养价值的重要参数。在氨基酸的消化率中，回肠末端真消化率因其有更好的可加性（Nyachoti等，1997）、合理性和准确性而被广泛采用，而要测定回肠末端真消化率，就必需正确评估动物的内源性氨基酸的排泄量。目前，内源性氨基酸的测定方法主要有以下......

损失的影响，被认为是直接测定猪采食含蛋白质日粮时内源氮损失的一种最有效的方法（Souffrant等，1986）。15N同位素标记技术可通过两种途径进行，一是对饲料蛋白质进行标记（Leterme等，1994；Roos等，1994），二是对动物的氨基酸库（de Lange,1989;Huisman等，1992；Schulze等，1994）即内源性氨基酸进行标记，其中以后者最为常用。此法的根本假定是，当15N在体内各部位达到恒态后，回肠末端内源氮中15N同血浆游离AA（血液氮前体池三氯乙酸溶解物）中15N相同。其基本操作为，持续往动物血液中灌注标记的氨基酸，标记内源氮的前体池，当15N标记物在血液氮前体池三氯乙酸（TCA）溶解物中达到稳定后，根据血液氮前体池三氯乙酸（TCA）溶解物中15N富集度同回肠末端食糜中15N之比即可推算出食糜中内源氮占总氮的比例（de Lang,1989;Huisman等，1992；Schulze等，1994）。

    在应用15N稀释技术时，被标记的含氮物的选择、15N 标记物在血液中的稳态的确定（15N富集度稳态的判断）和内源氮前体库的选择（Moughan等，1992）都直接影响内源氮估计的准确性。由于亮氨酸是很稳定的氨基酸，除蛋白质合成外没有其他重要的代谢功能（Grala等，1998），因此，15N-亮氨酸被普遍选作标记物；而回肠食糜内源15N的富集度与血清三氯乙酸（TCA）可溶部分中15N的富集度相似（Grala等，1998），因此可以以15N在血清TCA可溶部分中的稳定状态作为15N标记物的稳定态。但肠道氨基酸的再循环是十分迅速的，在血清总氮TCA可溶部分中，15N的富集存在昼夜变化。因此，人们对血清TCA可溶部分是否存在着15N富集的稳定态存在着质疑。然而，Alpers(1972)研究表明，被吸收氨基酸可不进入血液，而直接被肠细胞用于蛋白质的合成，所以，血清三氯乙酸可溶部分中15N的富集度可能低估了内源氨基酸的排出量。

    除此之外，用15N测定氨基酸的真消化率还存在很多问题。如，该法仅能直接测出一种氨基酸的消化率，而其他氨基酸的消化率是在假设其它氨基酸与此氨基酸的内源损失之间存在恒定的关系式而估计出来的，这一方法的可行性尚有疑问（Lien等,1993）；该方法的另一个问题是前体库中并非所有的含氮物是完全标记的（de Leng等,1992）。且该法费用昂贵，在实际应用中受到很大的限制。

    1. 213C 标记法

    13C标记法的原理是利用植物中自然富集的13C作为标记。已知大气中二氧化碳约含有1.1%同位素13C和98.9%的12C。在光合作用时，植物是排斥13C的(O`Leary,1981)。但植物通过二羧途径（C4途径）固定二氧化碳时，比通过Calvin（C3途径）循环对13C的排斥程度低（Minson等，1975）。玉米、高粱、甘蔗是C4植物，而小麦、大麦和大豆是C3植物。而动物在利用日粮氨基酸合成体蛋白时并不排斥13C（Minson,1975）。因此，用13C富集程度不同的日粮饲喂动物时，若能相应产生不同程度的标记，且在多种组织的标记率不同，利用同位素比率质谱仪就可用于测定13C的自然富集，从而对内源氮和氨基酸损失进行估计，测定不同日粮中的蛋白质和氨基酸的真消化率（Arentson等,1995）。Arentson等（1995）用13C作为标记，用小肠氨基酸组分13C的富集程度作为内源蛋白质标记的指数把回肠蛋白质区分为内源和未消化蛋白质两部分，测定了不同日粮的真氨基酸消化率。结果表明，13C标记方法可用于测定氨基酸的内源损失，但这种方法仍有与15N-相同的缺点，即标记物再循环，动物氮库的标记方法及代表内源氮分泌的组织选择问题，但因为13C在饲料中是自然富集的，并不需要另行标记，因此13C方法比标记15N的费用要低得多，但仍需用昂贵的同位素比质谱计。

    2. 高精氨酸法

    高精氨酸技术是由Hagemeister 和Erbesdobler(1985)首先提出的。原理是在一定条件下，通过甲基异脲（Methylisourea）与日粮赖氨酸发生胍基化反应将日粮赖氨酸转化为高精氨酸。当高精氨酸被动物体吸收后，在肝脏中精氨酸酶的作用下，又被重新转变为赖氨酸，同时释放出尿素。高精氨酸被机体吸收后不能用于蛋白质合成（不构成内源氮），因此吸收后的高精氨酸不会重新出现在肠道中，回肠食糜中存在的高精氨酸应该全部是外源性的，即为饲料中未被消化道吸收的外源蛋白质，其数量代表了未被消化的外源蛋白质的量（Souffrant,1991;Schmitz等,1991）。高精氨酸技术应用的前提条件有：（1）待测日粮蛋白中赖氨酸的胍基化反应必须完全（至少保证日粮中绝大数的赖氨酸都能转化为高精氨酸）；（2）胍基化反应不会影响动物对日粮蛋白质的消化吸收；（3）高精氨酸不在肠道中水解为赖氨酸和尿素；（4）高精氨酸同其它氨基酸一样进行吸收代谢；（5）高精氨酸不会重新出现在肠道中；（6）血液或肠道内的高精氨酸不会影响内源氮的损失（Drescher等,1994;Marty等,1994）。

     大量的研究证明，高精氨酸技术可用于直接测定内源赖氨酸和日粮赖氨酸真消化率（Rutherfurd 和Moughan,1990;Schmitz 等，1991；Marty等,1994）。但用此方法测定热损坏蛋白质的赖氨酸真消化率和内源赖氨酸损失时，须给予特别注意。因为只有当高精氨酸在待测饲料蛋白质中均匀分布时，样品才具有代表性，否则影响测定结果（Schulze 等，1994）。如果饲料蛋白质中的赖氨酸侧链被封闭，特别是经Maillard反应后被封闭，赖氨酸的侧链就不能与甲基异脲反应而转化高精氨酸，造成饲料蛋白质标记不完全，不具有代表性。在这种情况下，待测饲料高精氨酸的消化率只代表了未被热损害的部分蛋白质，而非整个待测饲料蛋白质的消化率，从而导致对内源赖氨酸损失及待测饲料赖氨酸真消化率的估测不准确（Schulze等，1994）。

    由于日粮赖氨酸胍基化反应的充分与否随日粮蛋白质来源的不同而有所差异，这就限制了该法的应用（Maga,1981;Rutherfurd and Moughan,1990;de Vrese 等,1994），所以该方法更适用于日粮的蛋白质来源只有一种时的情况。而在实际生产中，日粮蛋白质是

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