三倍体技术是国际上一项先进的生物技术。通过技术手段，使正常的二倍体生物的染色体加倍，以达到倍化效果。经过倍化处理得到的三倍体品种具有不育性及许多优良性状，使它体现出了很高的商业价值和生物学价值。目前，这一领域已成为海洋生物技术研究和开发的热点，国内外对这一技术的发展都极为重现，在不同领域都得到应用，尤其在水产领域的开发更为突出。以美国为首的一些发达国家，已利用先进的三倍体技术有力的推动了水产业的发展，创造了巨大的经济效益，而且一些品种已实现了产业化生产。

我区由于近几年二倍体太平洋牡蛎夏季大批死亡，严重抑制了太平洋牡蛎养殖业的发展。对于这一问题的解决，各方面都极为关注。根据理论研究和生产实践的验证，三倍体的不育性正是解决牡蛎夏季繁殖后大量死亡的有效途径之一。

一、 倍化处理技术

（一）6-DMAP诱导法：

1、器材：

500目、260目筛绢，显微镜，烧杯，量筒，计时电子表，15L塑料桶，1ml啄管，载玻片，棕色容量瓶，解剖工具(蛎钩解剖刀)。

2、药品及配置：

1）二甲基嘌呤（6-DMAP）配置方法：准备好饵料培育藻种的海水（经消毒过滤），提前在容量瓶内将1克药品溶于400ml海水中，摇匀，配置成0.0153mol／L的溶液待用。

2)次氯酸钠溶液：将其溶于海水中，配成5％的浓度，用于消毒。

附：药品用量计算

M1Ｖ1＝M2Ｖ2

Ｖ2＝M2Ｖ2÷M1

M1：0.0153mol／L

Ｖ1：未知量

M2：400μmol／L（6-MAP的倍化处理浓度）

Ｖ2：用量筒提前在15L水桶内定出一个标准体积（生产单位自由掌握）

3、苗室准备

1）成熟种贝：必需是性腺发育饱满，卵黄颗粒均匀，精子活动快。否则授精率低，影响孵化与倍化效果。

2）提前准备25.2℃-25.3℃的预热海水。

4、操作过程：

1）雌雄鉴别：

解剖：派专人解剖种贝，注意解剖时尽量不碰生殖腺，以免精液污染。每解剖一次必须将解剖工具浸入消毒液中消毒一下再用。

鉴别：用载玻片挤出精卵液沾水对光观察，颗粒散开的是雌的。无粒粘稠的是雄的。鉴别后要严格将雌雄种贝分开，载玻片每用一次都要消毒。

2）获卵：

获卵方法：用玻璃片将卵刮入盛25℃海水的容器内桶或烧杯。

定量：将卵液用260目筛绢过滤到15L的水桶内，定量。一般取1ml卵液稀释1000倍镜下定量。要求卵数在倍化处理时密度达到2万--3万个／ml。

3）授精：取多枚雄贝的精液（10--20枚），用少量泼入卵液中授精，搅拌均匀。同时计时。最好能检查一下授精情况，一般一个卵子周围有5个左右精子为宜，越少越好。授精5--6分钟以后，用500目筛绢滤出卵子，倒入标定好体积的水桶内，加水至定容线。15分钟时加药进行倍化处理。（这次过滤是为了滤出精子）

注：提前过滤是因为500目网过滤速度很慢，必须提前过滤，否则会延误倍化处理时间。定容的方法是用量筒量出一个标准体积，在桶上划线做标记，即为定容线。

4）倍化处理；15分钟时加入6-DMAP溶液，用量筒量Ｖ1数量的药液，倒入盛卵水桶内，使倍化处理浓度达到400μmol／L。处理15分钟，在12-13分钟时开始用500目网过滤。因过滤速度慢，需要提前过滤。

最后再向滤网中加水洗卵几次，滤好后入池孵化。（这次过滤是为了滤出药品）

注：在受精15分钟时处理是为了抑制第一极体的出现。

5）孵化：水温25℃。

以后育苗程序、技术、操作、管理如二倍体育苗。

（二）咖啡因诱导法：

1、器材：

260目筛绢、量筒、计时电子表、15L塑料桶、1ml啄管、载玻片、解剖工具50-100L左右的大容器、牙签。

2、药品及配置：

咖啡因：倍化处理浓度为10mmol／L，配置方法：2g／L，需提前2小时用高温水化开溶解，可以自配一定浓度，用时用量筒量出需要的药品量。

消毒；用热开水

3、苗室准备：

1）准备成熟种贝

2）准备25℃、35℃预热海水

4、育苗操作

1）雌雄鉴别：

解剖：同上

鉴别：用牙签挑生殖液沾到玻璃片上观察，挑完一个扔掉一个牙签。玻片在开水中消毒。鉴别后将种贝分开。

2）获卵：方法同上。要求卵数在倍化处理时密度达到1万个／ml。

3）授精：方法同上。授精后20分钟准备进行倍化处理。

4）倍化处理：在受精时间达到22-23分钟时，进行倍化处理。将Ｖ1体积的受精卵倒入Ｖ2体积的35℃的海水中，配置成Ｖ3体积的32℃-34℃的倍化海水，同时加入使V3体积海水达到10mol／L浓度的药品，进行倍化处理，处理15分钟后入池。

温度换算公式：25℃×Ｖ1＋35℃×Ｖ2＝（32－34℃）×Ｖ3

Ｖ3＝Ｖ1＋Ｖ2

注：入池前最好进行温度缓冲，即加入25℃海水降温。缓冲处理可在12分钟内进行。缓冲处理可避免温差大使受精卵受刺激，影响孵化率。在受精22-23分钟时，即第一极体刚一出现时进行倍化，这是为了抑制第二极体的出现。

5）孵化：在15分钟时，将受精卵倒入25℃孵化池中孵化。

以下操作基本同二倍体苗，只是需要在选育后第3天进行倒池。因为咖啡因处理，对卵损伤较大，幼虫畸形较多，此时倒池会淘汰掉畸形和死亡幼虫，避免污染水质。

二、看法与设想

这两项技术都在我区进行了生产实践，经过验证：6-DMAP处理法比较可靠，育苗三次，虽然效果有所差异，但都基本上获得了成功，比较适于普及推广。而咖啡因--温度休克法却在几次实践中遭到失败。总结教训，虽然原因众多，但也发现这一技术还存在有许多不稳定因素，不易掌握。因此它的可靠性和技术的成熟度，还需在以后的生产实路中经过验证和提高。

通过实践，我们从成功与失败中吸取了许多宝贵的经验教训，对这一技术大家都有了比较深的认识，下面是我们的一些看法与设想。

1、针对6--DMAP诱导法

这一方法具有安全可靠，操作比较方便，孵化率、倍化率、幼虫成活率都比较高的特点。一般孵化率可达30％-40％，倍化率可达50％以上。但在操作中500目网的两次过滤处理比较占时费力。而且药品和500目网都比较紧张，价格也比较昂贵。

但我们按如下成本换算：

药品用量 1000元/克

0.0652g → 62.5元

↑400μmol/L浓度处理 

倍化处理时受精卵密度按3000万/ ml

↓孵化率30%

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